La persecución de Diocleciano o Gran fue la última y más severa persecución de los cristianos en el Imperio Romano. En 303, los emperadores Diocleciano, Maximiano, Galerio y Constancio emitieron una serie de edictos rescindiendo los derechos legales de los cristianos y exigiendo que cumplieran con las prácticas religiosas tradicionales. Edictos posteriores se dirigieron al clero y exigieron un sacrificio universal, ordenando a todos los habitantes sacrificar a los dioses. La persecución varió en intensidad en todo el imperio: más débil en la Galia y Britania, donde solo se aplicó el primer edicto, y más fuerte en las provincias orientales. Las leyes persecutorias fueron anuladas por diferentes emperadores (Galerio con el Edicto de Serdica en 311) en diferentes momentos, pero el Edicto de Milán de Constantino y Licinio (313) ha marcado tradicionalmente el final de la persecución.

Los cristianos habían sido objeto de discriminación local intermitente en el imperio, pero los emperadores anteriores a Diocleciano se mostraron reacios a promulgar leyes generales contra el grupo religioso. En la década de 250, bajo los reinados de Decio y Valeriano, los súbditos romanos, incluidos los cristianos, se vieron obligados a sacrificar a los dioses romanos o enfrentar el encarcelamiento y la ejecución, pero no hay evidencia de que estos edictos tuvieran la intención específica de atacar al cristianismo. Después de la adhesión de Galieno en 260, estas leyes quedaron en suspenso. La asunción al poder de Diocleciano en 284 no marcó un cambio inmediato en la falta de atención imperial hacia el cristianismo, pero sí anunció un cambio gradual en las actitudes oficiales hacia las minorías religiosas. En los primeros quince años de su gobierno, Diocleciano purgó el ejército de cristianos, condenó a muerte a los maniqueos y se rodeó de opositores públicos al cristianismo. La preferencia de Diocleciano por un gobierno activista, combinada con su imagen de sí mismo como restaurador de la pasada gloria romana, presagiaba la persecución más generalizada en la historia de Roma. En el invierno de 302, Galerio instó a Diocleciano a iniciar una persecución general de los cristianos. Diocleciano desconfiaba y pidió orientación al oráculo de Apolo en Dídima. La respuesta del oráculo se leyó como un respaldo a la posición de Galerio, y se convocó una persecución general el 23 de febrero de 303.

Las políticas persecutorias variaron en intensidad en todo el imperio. Mientras que Galerio y Diocleciano eran ávidos perseguidores, Constancio no estaba entusiasmado. Los edictos persecutorios posteriores, incluidos los llamados al sacrificio universal, no se aplicaron en su dominio. Su hijo, Constantino, al asumir el cargo imperial en 306, restauró a los cristianos a la plena igualdad legal y devolvió las propiedades que habían sido confiscadas durante la persecución. En Italia, en 306, el usurpador Majencio expulsó al sucesor de Maximiano, Severo, prometiendo total tolerancia religiosa. Galerio puso fin a la persecución en Oriente en 311, pero su sucesor, Maximino, la reanudó en Egipto, Palestina y Asia Menor. Constantino y Licinio, el sucesor de Severo, firmaron el Edicto de Milán en 313, que ofrecía una aceptación más completa del cristianismo que la que había proporcionado el edicto de Galerio. Licinio expulsó a Maximino en 313, poniendo fin a la persecución en Oriente.

La persecución no logró detener el surgimiento de la Iglesia. Hacia el año 324, Constantino era el único gobernante del imperio y el cristianismo se había convertido en su religión favorita. Aunque la persecución resultó en la muerte, tortura, encarcelamiento o dislocación de muchos cristianos, la mayoría de los cristianos del imperio evitaron el castigo. Sin embargo, la persecución provocó que muchas iglesias se dividieran entre quienes habían cumplido con la autoridad imperial (los traditores) y quienes habían permanecido "puros". Ciertos cismas, como los de los donatistas en el norte de África y los melitianos en Egipto, persistieron mucho después de las persecuciones. Los donatistas no se reconciliarían con la Iglesia hasta después del 411. Algunos historiadores consideran que, en los siglos que siguieron a la era persecutoria, los cristianos crearon un "culto a los mártires", y exageraron la barbarie de las persecuciones. Otros historiadores que utilizan textos y evidencias arqueológicas de la época afirman que esta posición es errónea. Los relatos cristianos fueron criticados durante la Ilustración y después, sobre todo por Edward Gibbon. Esto se puede atribuir al tenor político anticlerical y secular de ese período. Los historiadores modernos, como G. E. M. de Ste. Croix, han intentado determinar si las fuentes cristianas exageraron el alcance de la persecución de Diocleciano, pero continúan los desacuerdos.