马耳他大围攻（马耳他语：L-Assedju l-Kbir）发生在 1565 年，当时奥斯曼帝国试图征服马耳他岛，当时由医院骑士团控制。围攻持续了近四个月，从 1565 年 5 月 18 日到 9 月 11 日。

自 1530 年以来，医院骑士团的总部一直设在马耳他，在 1522 年罗得岛被围困之后，同样被奥斯曼人赶出罗得岛。奥斯曼帝国于 1551 年首次尝试占领马耳他，但失败了。 1565年，奥斯曼帝国苏丹苏莱曼大帝第二次尝试占领马耳他。大约 500 人的骑士和大约 6,000 名步兵经受住了围攻并击退了入侵者。这场胜利成为 16 世纪欧洲最著名的事件之一，伏尔泰说：“没有什么比围攻马耳他更出名的了。”毫无疑问，它最终削弱了欧洲对奥斯曼帝国不可战胜的看法，尽管多年来基督教联盟和穆斯林土耳其人继续争夺地中海。围攻是基督教联盟和伊斯兰奥斯曼帝国之间不断升级的竞争的高潮1551 年土耳其对马耳他的进攻，1560 年在杰尔巴海战中奥斯曼帝国摧毁盟军基督教舰队，以及 1571 年在勒班陀海战中决定性的奥斯曼帝国战败。